近日，中国海洋大学医药学院李德海教授和张国建教授团队在合成生物学及代谢工程知名期刊Metabolic Engineering (1区，IF=8.4)上发表了一篇题为“Cyclo-diphenylalanine Production in Aspergillus nidulans through Stepwise Metabolic Engineering”的研究论文。该论文报道了以构巢曲霉为底盘细胞，在不添加任何有机氮源的前提下，实现以葡萄糖为碳源从头、高效合成天然环苯丙氨酸二酮哌嗪类结构。
环二苯丙氨酸(cFF)是一种对称芳香族二酮哌嗪(DKP)，广泛存在于微生物、植物和食品中。由于cFF具有不同的生物活性以及作为多种活性化合物的关键前体，而化学合成方法经常造成环境和可持续性发展的问题。因此，利用微生物作为“细胞工厂”，基于代谢工程手段环保生产cFF具有巨大的应用前景。
图1 cFF生物合成的代谢途径及其代谢工程策略
在微生物中，二酮哌嗪主要由两种来源途径:（1）真菌中的非核糖体肽合成 途径(NRPS)和（2）细菌中依赖于氨基酰-tRNA的环二肽合成酶途径(CDPS)。在该研究中，首先通过基因组挖掘手段从海洋真菌Penicillium janthinellum HDN13-309中获得一个负责cFF合成的NRPS基因penP1，并在丝状真菌模式菌株Aspergillus nidulans中进行异源表达，初步建立cFF的生产体系。为了降低生产成本并提高生产效率，作者继而通过如下三个步骤对A. nidulans A1145宿主底盘进行代谢工程改造，以提高苯丙氨酸前体的供应：（1）敲除天然的苯丙氨酸氨裂合酶(PALs)和3-脱氢莽草酸脱水酶(DHSD)，阻断了苯丙氨酸消耗通路和莽草酸途径中生成酚酸的分支通路；（2）过表达解除反馈抑制的3-脱氧-D -阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶和分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(PheA)，以增强由赤藓糖-4-磷酸 (E4P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)合成苯丙氨酸的通路；（3）引入基于磷酸转酮酶(PHK)的途径，将糖酵解途径碳流通量更多地导向E4P的合成（图1）。
通过上述对A. nidulans A1145的逐步改造策略，最终获得的工程菌株采用无氨基酸培养基于摇瓶培养条件下实现cFF产量滴度611 mg/L。最后在5-L发酵罐采用分批补料发酵培养，将cFF滴度进一步提高至2.5 g/L（图2）。该研究在成功改造莽草酸和芳香族氨基酸合成途径的基础上，建立了运用构巢曲霉底盘细胞系统高效生产天然来源二酮哌嗪的平台，展示了丝状真菌在生产天然聚肽类天然产物方面的巨大潜力。
图2. 摇瓶发酵条件及5-L发酵罐分批补料发酵条件下cFF滴度
中国海洋大学为第一通讯单位，张国建教授和纽约州立大学Blaine A. Pfeifer教授为共同通讯作者，医药学院博士研究生刘小林为文章第一作者，硕士生李康、于婧博士、马传腾博士、车茜副教授、朱天骄教授和李德海教授为文章共同作者。该工作得到国家自然科学基金、崂山实验室青岛海洋科技中心科技创新项目、三亚崖州湾科技城海南省联合项目、山东省泰山学者青年专家项目和山东省自然科学基金重大基础研究项目的资助。
文章链接：https://doi.org/10.1016/j.ymben.2024.02.009
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